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感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)

更新時間:2012-12-17 點(diǎn)擊量:1388

一、CaCl2 感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟

.前夜接種受體菌( DH5α或 DH0B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜(約6小時);

2.取 ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于00ml LB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(250-300rpm);

3.將 0.M CaCl2 溶液置于冰上預(yù)冷;

以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

4.吸取 .5ml培養(yǎng)好的菌液至.5ml離心管中,在冰上冷卻0分鐘;

5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;

6.棄去上清,加入 00μl預(yù)冷0.M CaCl2 溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮,在冰放置20分鐘;

7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;

8.棄去上清,加入 00μl預(yù)冷0.M CaCl2 溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮;

9.細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑( 5% - 20%甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃)。

二、電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟

.前夜接種受體菌( DH5α或 DH0B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜;

2.取 2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600 =0.6(約2.5-3小時);

3.將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作

4.吸取 .5ml培養(yǎng)好的菌液至.5ml離心管中,在冰上冷卻0分鐘;

5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;

6.棄去上清,加入 500μl冰冷的0%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮;

7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘

8.棄去上清,加入 750μl冰冷的0%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮;

9.4℃下3000g冷凍離心5分鐘

0.加入 20μl冰冷0%的甘油,用移液器輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮;

.立即使用或迅速置于 -70℃超低溫保存。

附注:

影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過程中應(yīng)注意的事項(xiàng):

.細(xì)菌的生長狀態(tài):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度,盡量使用對數(shù)生的細(xì)胞(一般通過檢測OD600 來控制。DH5α菌株 OD600 為 0.5 時細(xì)胞密度是 5 × 07 /ml );

2.所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行;

3.經(jīng) CaCl2 處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加, 24小時達(dá)到zui高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的);

4.化合物及無機(jī)離子的影響:在 Ca 2+ 的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子(如 Mn 2+ 或 Co 2+ )、 DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高( 00-000 倍);

5.所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率;

6.質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的 DNA ;

7.一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比。

詳情請看:感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)

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