SNP的檢測(cè)知識(shí):
人類基因組中存在著廣泛的多態(tài)性,zui簡單的多態(tài)形式是發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代,即單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。SNP通常是一種二等位基因的(biallelic),即二態(tài)的遺傳變異,SNP的數(shù)量大、分布廣,在組成人類基因組的30億個(gè)堿基中,平均每000個(gè)就有一個(gè)SNP。SNP作為第三代遺傳標(biāo)記,在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián)分析、個(gè)體疾病易感性分析與藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)的研究中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。ELISA試劑盒
.直接測(cè)序法進(jìn)行SNP分析
在所有SNP的檢測(cè)方法中,對(duì)欲檢測(cè)片段進(jìn)行直接擴(kuò)增、測(cè)序是zui為準(zhǔn)確的方法。通常情況下,純合型SNP位點(diǎn)的測(cè)序峰為單一峰型,而雜合型SNP位點(diǎn)的測(cè)序峰為套峰,因而很容易將其區(qū)分開來。通過直接測(cè)序方法進(jìn)行SNP檢測(cè)的檢出率接近00%。
2. PCR-SSCP方法
單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single-strand conformation polymorphism,SSCP)是一種簡單、地檢測(cè)DNA或RNA序列中點(diǎn)突變的技術(shù),由于實(shí)驗(yàn)成本較低,也是一種目前較為常用的方法。
檢測(cè)原理:
單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象,這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的,當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí),會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象,使構(gòu)象發(fā)生改變,空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此,通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。ELISA試劑盒
需要注意的問題:
A.PCR-SSCP只能作為一種突變檢測(cè)方法,要zui后確定突變的位置和類型,還需進(jìn)一步測(cè)序。
B.由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的,這樣就可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時(shí),再加上其他條件的影響,使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。
C.經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變,90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)。ELISA試劑盒